RNAscope Plus：一款可實現(xiàn)miRNA/siRNA/ASO與mRNA同時檢測的熒光RNA原位雜交技術(shù)
作為新一代RNA原位雜交技術(shù)的代表，美國Bio-Techne旗下的Advanced Cell Diagnostics（ACD）品牌研發(fā)的RNA原位雜交檢測技術(shù)，包括RNAscope，Basescope，miRNAscope已涵蓋了對所有RNA（長度大于300nt的長鏈RNA、50-300nt的RNA片段、外顯子跳躍的RNA、環(huán)狀RNA、以及17-50nt的小RNA，例如miRNA、siRNA、ASO等）的原位檢測。
在腫瘤、神經(jīng)、代謝等領(lǐng)域，非編碼小RNA作為一類調(diào)節(jié)性RNA分子，越來越多受到研究人員的關(guān)注，它們在一些疾病的發(fā)生發(fā)展過程中可能具有關(guān)鍵性作用。同時，由于小RNA分子作為一類基因表達(dá)調(diào)節(jié)性因子，在基因治療領(lǐng)域也具有很大潛力。針對于miRNA、siRNA、ASO等這類分子的原位檢測，可以使用miRNAscope實現(xiàn)，但同時檢測調(diào)節(jié)性分子以及被調(diào)節(jié)的靶標(biāo)RNA分子表達(dá)變化，也具有非常廣泛的需求。為此，ACD日前推出了RNAscope Plus技術(shù)，將對小RNA的檢測和mRNA的檢測結(jié)合起來，可以實現(xiàn)同一張切片上同時對1個miRNA/siRNA/ASO和最多3個mRNA分子進(jìn)行熒光檢測。
RNAscope Plus結(jié)合了miRNAscope和RNAscope分別的探針設(shè)計以及信號放大系統(tǒng)，可對已有的小RNA及mRNA探針兼容。對mRNA檢測部分依舊采用“雙Z型探針“及信號放大，增加小RNA分子檢測后，不影響mRNA的信號。對小RNA的檢測，采用鏈狀探針及信號放大，可針對siRNA、ASO序列進(jìn)行個性化探針設(shè)計。成像后依舊可利用分析軟件對mRNA信號進(jìn)行定量分析。
得益于ACD專利的探針設(shè)計及信號放大技術(shù)，小RNA分子及mRNA分子的信號最終都可獲得高信噪比。下圖展示在細(xì)胞片中對miR-205和3個mRNA的陽性對照探針及陰性對照探針的檢測。陽性對照中各個通道上的信號點清晰，陰性對照中全片非常干凈，體現(xiàn)出方法的高特異性。
在小鼠腦組織切片的檢測中，也可獲得理想的結(jié)果。SNORD85可在小鼠腦某些細(xì)胞中特異性表達(dá)，下圖中除了對SNORD85進(jìn)行檢測外，也對小鼠的神經(jīng)元（Rbfox3）、星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP）、小膠質(zhì)細(xì)胞（Aif1）同時進(jìn)行檢測，可見不同靶標(biāo)特異的定位特征。
針對同一個miR-205分子，對比使用RNAscope Plus的熒光信號與使用可見光試劑盒miRNAscope的可見光紅染信號，二者對于miR-205不同表達(dá)豐度的細(xì)胞中小RNA分子的檢出結(jié)果有較高的一致性，證明不同的顯色方式對于靶標(biāo)的檢測沒有影響。
RNAscope技術(shù)是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)品牌研發(fā)的RNA原位雜交產(chǎn)品，在近年來的生物檢測領(lǐng)域發(fā)展迅速。與傳統(tǒng)的RNA原位雜交相比，RNAscope技術(shù)屬于新一代RNA原位雜交技術(shù)，其特異性的雙Z探針設(shè)計避免了傳統(tǒng)長鏈RNA探針的弊端，配以自身級聯(lián)放大檢測原理，可以高效敏感地檢測到目標(biāo)RNA。該方法的具體優(yōu)勢如下：
應(yīng)用廣泛
使用RNAscope技術(shù)，靶點RNA為大于等于300個堿基的特異序列，即可進(jìn)行探針設(shè)計。因而RNAscope技術(shù)可以應(yīng)用于幾乎所有物種，所有組織以及所有基因的檢測。
特異性強
RNAscope獨特的雙Z（ZZ） 探針設(shè)計有效的防止了探針的非特異性結(jié)合，同時降低了背景干擾。由于結(jié)合在非特異性位點的單個的Z 探針不會產(chǎn)生完整的信號放大分子結(jié)合位點，并會在雜交過程中被洗脫掉，從而防止非特異性信號的放大，使得探針的信號具有高度特異性。探針設(shè)計合成需要2~4周時間即可完成。
靈敏度高
RNAscope方法檢測每個RNA 分子時，只需三對雙Z（ZZ）探針即可完成雜交和信號的可視化。
單分子可視化和單細(xì)胞定量
使用RNAscope技術(shù)雜交上三對及以上雙Z 探針即可在標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡下呈現(xiàn)可觀察到的點狀信號。ACD公司提供的分析軟件更可以定量每一個單細(xì)胞內(nèi)RNA 的表達(dá)水平。
兼容降解的RNA
由于RNAscope三對雙Z探針即可檢測到目標(biāo)RNA，而通常針對靶點RNA設(shè)計的探針為20對雙Z 探針，因而即使目標(biāo)RNA發(fā)生部分降解，仍可以穩(wěn)定有效地檢測到靶點RNA。
檢測結(jié)果穩(wěn)定一致性
RNAscope技術(shù)用到的探針以及所有檢測試劑全部由工業(yè)化合成，且該技術(shù)針對不同樣本類型（冰凍切片， 石蠟切片，懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞等）已經(jīng)有成熟的實驗操作流程，故使得RNAscope技術(shù)檢測結(jié)果具有穩(wěn)定性和一致性。除了可以在實驗室進(jìn)行手工操作外，該產(chǎn)品也可以在Leica以及羅氏Ventana自動平臺上運行，為結(jié)果的一致性和穩(wěn)定性提供了可靠的依據(jù)。
多通道多靶點同時檢測
由于RNAscope技術(shù)可以同時進(jìn)行多通道探針雜交以及信號放大，故在可見光檢測中可以在同一張切片上同時檢測兩個靶點；而在熒光檢測過程中，可以在同一張切片上檢測三個或三個以上靶點RNA。
在RNAscope技術(shù)的基礎(chǔ)上，ACD品牌旗下的Basescope技術(shù)可以檢測RNA水平的外顯子跳躍，點突變，環(huán)狀RNA等；miRNAscope可以原位對小RNA，包括miRNA, siRNA, ASO進(jìn)行追蹤定位；而近年來推出的RNAscope HiPlex技術(shù)則可以在一張石蠟切片上同時檢測最多12個RNA靶標(biāo)的分布定位，成為神經(jīng)科學(xué)，腫瘤微環(huán)境研究以及單細(xì)胞測序后驗證等領(lǐng)域的常用檢測方法。
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