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RT-qPCR是分子生物研究中缺乏重復性的典范

2021/12/24 13:35:28??????點擊：

Real-Time qPCR（RT-qPCR）優(yōu)點眾多，目前已成為生命科學領(lǐng)域的一項常規(guī)技術(shù)，越來越多的研究文章中涉及到RT-PCR實驗，也基本上被Real-Time qPCR所替代。近十幾年來，RT-qPCR的論文大量發(fā)表，仍面臨著專業(yè)規(guī)范的問題。

主要表現(xiàn)在以下兩個方面>>

01 70%-80%提供數(shù)據(jù)仍不采用PCR實驗指南（MIQE）數(shù)據(jù)規(guī)范及實時定量PCR數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu)化語言和報告指南（RDML）語言規(guī)范，表達不規(guī)范、說服力不足、結(jié)果表述不清、數(shù)據(jù)無法重復等問題導致被撤稿。

02 追求試劑“低價”或“品牌崇拜”，缺乏科學的試劑質(zhì)量評價方法，方法體系的不嚴謹將造成錯誤的結(jié)論。

2017年Stephen Bustin等調(diào)查顯示——說一套，做一套，RT-qPCR是分子生物研究中缺乏重復性的典范。（Talking the talk, but not walking the walk：RT-qPCR as a paradigm for the lack of reproducibility in molecularresearch）作者指出許多分子生物學研究缺乏重現(xiàn)性的根本原因是分子測量方法報告不充分。RT-qPCR是RNA定量最直接的測量技術(shù)之一，廣泛應(yīng)用于研究、診斷、法醫(yī)和生物技術(shù)應(yīng)用，盡管定量PCR實驗指南(MIQE)旨在提高RT-qPCR數(shù)據(jù)報告的規(guī)范性和透明度，但調(diào)查顯示錯誤的試驗方法、不適當?shù)臄?shù)據(jù)分析和不充分的報告仍然普遍存在，大多數(shù)已發(fā)表的RT-qPCR數(shù)據(jù)可能造成實驗結(jié)論誤導。

結(jié)果再現(xiàn)性問題

2013年，《自然》(Nature)雜志發(fā)表的一篇論文綜述得出結(jié)論，自MIQE指南發(fā)布以來，有關(guān)RT-qPCR方案的必要信息的報告實際上有所惡化。雖然指南強烈建議納入必要的技術(shù)信息，但分析的10篇論文中沒有一篇報道了這一信息。這意味著沒有向讀者提供任何有關(guān)RNA完整性、RNA純度、RT條件或PCR效率的信息，而且所有的出版物都使用了一種不恰當?shù)臄?shù)據(jù)分析方法，這種方法在15年前已經(jīng)被質(zhì)疑。作者對《自然》雜志的20篇近期論文進行了重復分析，得出了基本相同的結(jié)論。更諷刺的是，報道透明度與期刊的影響因子呈負相關(guān)。

研究RNA表達的方法

RNA圖譜分析依賴于多種方法，有些方法相對簡單，有些方法則復雜得多，有些方法限制于低通量，還有一些方法允許并行處理大量樣本。作者對目前使用的主要RNA分析方法進行了簡要概述，闡述了許多使用基于RNA的方法發(fā)布的數(shù)據(jù)的可靠性和生物/臨床相關(guān)性引發(fā)激烈辯論的問題，并闡明了導致這些結(jié)果不可靠且需要修正的各種原因

01PCR是目前大多數(shù)使用的方法，而使用凝膠電泳進行PCR分析仍在繼續(xù)使用。對PCR相關(guān)衍生的問題的認識由來已久，早在1992年就有第一份報告描述了實驗室內(nèi)和實驗室之間對復制和連續(xù)標本進行評估的不一致性。缺乏一個涉及PCR的動態(tài)過程的理論理解，特別是關(guān)于不可復制或意想不到的擴增產(chǎn)物的擴增，在幾十年前也被強調(diào)。這些觀察結(jié)果和由此產(chǎn)生的影響在很大程度上被忽略了。
02

qPCR和RT-qPCR是快速、簡單定量核酸的方法，并繼續(xù)被廣泛使用，2016年P(guān)ubMed搜索逆轉(zhuǎn)錄實時PCR或RT-qPCR或qRT-PCR，有近5400個引用。但是該方法的再現(xiàn)行?？煽啃院鸵恢滦允盏劫|(zhì)疑，

微陣列技術(shù)與RT-qPCR相比可以處理更多的樣本，比但由于執(zhí)行和分析數(shù)據(jù)所需的復雜性和時間的增加，這種方法的流行度正在下降，2016年P(guān)ubMed搜索“微陣列”一詞大約有1600個引用。

RNA-seq是所有RNA profiling方法中技術(shù)最復雜、最昂貴、最耗時的一種，使得復制或重復實驗的可行性較低。

另外兩種中等通量的RNA分析方法是NanoString公司的nCounter分析系統(tǒng)和Thermo Fisher公司的OpenArray系統(tǒng)。前者的優(yōu)點是不需要RT步驟，后者減少了所需的樣品處理量。比較兩種技術(shù)和RT- qPCR的mRNA豐度分析發(fā)現(xiàn)，三種方法的結(jié)果具有廣泛的可比性。然而，盡管NanoString和OpenArray的結(jié)果有很好的相關(guān)性，但RT- qPCR數(shù)據(jù)與兩者有顯著差異。作者將其歸因于常規(guī)RT-qPCR需要大量的移液操作，從而增加了樣品制備的可變性。這些結(jié)果也表明，即使以適當?shù)姆绞竭M行了技術(shù)和分析，結(jié)果也可能是不一致的。這也存在一種可能，即RT-qPCR結(jié)果是正確的，而其他兩種方法得到的結(jié)果是錯誤的。

RT-qPCR存在的問題

RT- qPCR工作流程表面上簡單的結(jié)果是，一方面，許多未經(jīng)培訓和不熟練的操作人員采用了這項技術(shù)。另一方面，不知道從哪里查找并識別問題所在，確定報告的結(jié)果是否可能是真實的。下面概述了妨礙對結(jié)果進行一致解釋的方法問題，并舉例說明了為什么報告的結(jié)果常常如此不可靠。

01RNA的質(zhì)量

相關(guān)的質(zhì)量控制措施是任何分子生物學實驗前的必要準備工作，包括確?？煽康膓PCR檢測。RNA在提取和保存過程中有各種物理和化學因素的降解核酸，因此純度和完整性是非常重要的。RIN值大于5的總RNA可以劃分為優(yōu)質(zhì)RNA，大于8的RNA可以劃分為完美RNA。這并不是一個理想的分類，因為降解與抑制類似，它不是一個恒定或穩(wěn)定的過程，而是以不同的方式影響轉(zhuǎn)錄。這種不一致的一個嚴重后果是，對純度或降解程度不同的樣品進行比較，可能會顯示出差異，實際上并沒有差異，或者掩蓋了任何實際差異。這種不一致性直接影響基因表達結(jié)果，從而會影響實驗結(jié)論。

02逆轉(zhuǎn)錄步驟

在首次PCR實驗報道后不久，結(jié)合RT和PCR步驟檢測RNA靶點的潛力就被發(fā)現(xiàn)了，并在隨后不久被建議將其用作定量分析。隨后發(fā)現(xiàn)，定量RNA并不像定量DNA那樣簡單，比如RNA逆轉(zhuǎn)錄后通過PCR進行擴增取決于RNA濃度和引物設(shè)計以及在引物結(jié)合位點避免大量的二級結(jié)構(gòu)，不同的RT酶受到這些二級結(jié)構(gòu)的不同影響。逆轉(zhuǎn)錄步驟實際上是可變的，因為它是由不同的實驗人員進行的，實驗人員使用了不同數(shù)量的RNA、各種cDNA反轉(zhuǎn)錄的方法和不同的逆轉(zhuǎn)錄酶。這導致了不同實驗室報告的RT-qPCR結(jié)果可能不一致，而且很難確定哪些結(jié)果是真實的，哪些結(jié)果是錯誤的，尤其是在沒有足夠的分析設(shè)計參數(shù)和實驗方案信息的情況下。

03PCR步驟

聚合酶鏈反應(yīng)的穩(wěn)定性并不像看上去那么好，這有幾個原因：

a.許多已發(fā)表的PCR分析要么設(shè)計不充分，不可能只擴增預(yù)期的目標，要么發(fā)表的信息不正確，導致發(fā)表錯誤的引物或探針序列；

b.最佳的PCR性能在很大程度上取決于適當?shù)哪０逯苽浞椒ǎ?/span>

c.認為qPCR檢測分辨率足夠高的假設(shè)是錯誤的。

d.不同制造商的“定量PCR預(yù)混液”是不同的，不同預(yù)混液可能會影響最后的“差異倍數(shù)”值；

e.對于一些目的基因，選擇一步法RT-qPCR和兩步法RT-qPCR也會造成結(jié)果的不一致；

f.許多商業(yè)化熱啟動Taq在熱啟動前似乎沒有經(jīng)制造商的封閉性測試，容易產(chǎn)生非特異性擴增，形成引物二聚體；

g.目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率不在線性范圍內(nèi)，而且二者的擴增效率也不一致，這極大影響了實驗結(jié)果的真實性。

規(guī)范操作建議

01引物和探針的驗證

由于任何PCR檢測的特異性和效率都嚴重依賴于引物和探針，如果使用，這些都需要仔細檢查。實際應(yīng)用中有頻繁的錯誤，包括簡單的排版錯誤，對寡核苷酸序列取向混亂，缺乏特異性的引物，設(shè)計跨內(nèi)含子的PCR擴增子。

02測定核酸的質(zhì)量和完整性

核酸的質(zhì)量和完整性對于定量結(jié)果的影響是很大的，報告中為提供此項內(nèi)容，意味著永遠不清楚作者是否真的檢查了抑制劑的存在，并確定了RNA樣本的完整性，或者只是不報告他們的結(jié)果。

03RT步驟做3個重復

RT步驟應(yīng)該以3個重復的方式進行，而對于每個RT反應(yīng)只進行一個qPCR就足夠了。

04PCR的擴增效率應(yīng)該一致

擴增效率的不一致，在使用2^-△△cq進行基因表達分析時，得到的fold changes值是不準確的，不是真實變化值，這可能會極大地提高基因表達分析的準確性。

05選擇穩(wěn)定表達的內(nèi)參

使用多個、穩(wěn)定且經(jīng)過驗證的內(nèi)參基因?qū)T-qPCR數(shù)據(jù)歸一化至關(guān)重要，因為它消除了固有技術(shù)或?qū)嶒炚T導的差異。

06提供原始數(shù)據(jù)

Cq數(shù)據(jù)應(yīng)該作為補充信息提交，可以以電子表格的形式提交，也可以直接以RDML格式導出。

為了幫助科研用戶更好地甄別定量試劑的特異性和穩(wěn)定性，提高實驗的重現(xiàn)性可嚴謹性，我們推出了NTC挑戰(zhàn)市場活動（僅擴增無模板陰性對照），得到了熱烈反響，在活動推出一個月以來，我們收到了來自不同單位的大量的對比數(shù)據(jù)，充分證明了試劑間存在的差異會導致定量結(jié)果的巨大差異，下面附上三個案例：

案例一

北大某課題組，所用試劑為QST-100和國內(nèi)B公司、Y公司，使用儀器為 ABI 7500.