RNAscope常見問題小貼士-樣本制備篇
美國Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司的RNAscope技術作為新一代的RNA原位雜交技術，通過其專利的雙Z探針設計原理以及信號級聯(lián)放大系統(tǒng)，可以兼容由于空氣中RNA酶對于RNA的部分降解導致一定程度的組織RNA缺損，從而達到對組織和細胞內的RNA進行高效的原位檢測。
在使用RNAscope，Basescope以及miRNAscope對石蠟樣本，新鮮冰凍和固定冰凍樣本的組織切片進行原位雜交的過程中，經(jīng)常會遇到各種各樣的技術問題。本專題就一系列典型代表性的問題進行歸類總結。本篇聚焦樣本制備步驟，給大家提供一些相關小貼士。
對于RNAscope類實驗的樣本制備，說明書里有比較詳細的說明。需要注意的事項有以下一些：
石蠟樣本的制備中，在冰上取材后建議第一時間放入10%中性福爾馬林固定液（10%NBF）浸泡16-32小時。固定液的體積建議至少是組織體積的10-20倍。充分固定組織樣本是RNA原位檢測的成敗關鍵之一。經(jīng)過充分固定的組織樣本內的RNA可以與蛋白進行交聯(lián)。從而達到最佳的保護效果。
對于新鮮冰凍樣本制備，需要提前準備好冰凍包埋模具（如下圖）以及倒入模具備用的OCT，以及盛有干冰的盒子或者-80℃冰箱。在組織取材時，在冰上將組織剝離后，切成適當大小后浸入預先倒入OCT的包埋模具中，之后快速將含有組織塊和OCT包埋模具放入裝有干冰的封閉盒子內或者直接放入-80℃冰箱。每個包埋模具浸入組織后第一時間放入干冰或者-80℃內進行冷凍保存。不建議積攢一批后再進行后續(xù)操作。組織樣本要在干冰或者-80℃冰箱內至少過夜保存后再進行切片處理。
對于灌注固定的樣本，建議客戶使用新鮮配制的4%多聚甲醛（4%PFA）對動物進行灌注固定。組織取材后繼續(xù)放入新鮮的4%多聚甲醛（4% PFA）在4℃進行固定24小時。之后依次浸入15%和30%的蔗糖溶液中（4℃）至樣本沉入底部（依據(jù)樣本大小不同時間不同）。此步可以保護組織細胞形態(tài)。之后將組織塊浸入裝有OCT的組織包埋盒內，放入-80℃冰箱至少過夜后在進行切片制備。此步有一個關鍵點即4%多聚甲醛的有效性問題。由于多聚甲醛屬于強還原性試劑，故不像10%中性福爾馬林固定液那樣可以在室溫長期保存。4%PFA會隨著時間發(fā)生氧化，從而固定效果大打折扣。為了最大程度的維持4%PFA的固定效果，建議使用新鮮配制（當天配置）的4%PFA進行固定。如果當日不方便配置，可以事先配置好4%PFA，分裝并直接凍在-20℃，使用前拿出一只融化后立即使用。
一般依據(jù)以上提示制備的組織石蠟塊或者冰凍組織塊，進行后續(xù)常規(guī)切片并相應的RNAscope, Basescope或者miRNAscope檢測，組織樣本可以通過質控（QC）檢測，即陽性對照探針檢測評分≧2，陰性對照為0。值得注意的是，石蠟塊相較于冰凍組織塊，可以更為長期的保存。經(jīng)驗證經(jīng)過上述標準化固定5-10年的石蠟塊在進行了石蠟切片后仍然可以通過RNAscope質控檢測，并進行靶探針檢測。值得注意的事，石蠟切片一旦切出來后，需要在2個月內完成實驗。
除了常規(guī)組織樣本外，有研究團隊使用到1）微小組織樣本，例如類器官，3D培養(yǎng)細胞團或者小型昆蟲等樣本；2）骨骼組織或軟骨樣本；3）血液樣本進行RNAscope檢測，這幾類樣本同樣可以制備成石蠟塊，并進行RNAscope檢測。針對于這類樣本的石蠟塊制備流程，本公眾號之前的有相關樣本制備的軟文參考。骨骼樣本固定， 脫鈣及制備方法請參見題目為：RNA原位檢測中，骨和軟骨樣本制備處理技術淺談及應用；微小樣本制備請參見1）題目為：RNAscope技術在類器官中的應用舉例以及類器官石蠟樣本制備簡介；以及2）題目為：在談RNAscope技術與類器官的相關文章。更多類型樣本制備，例如血液樣本制備等問題可直接與我公司FAS團隊或者通過本公眾號聯(lián)系詢問。
RNAscope技術是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研發(fā)的RNA原位雜交產(chǎn)品，在近年來的生物檢測領域發(fā)展迅速。與傳統(tǒng)的RNA原位雜交相比，RNAscope技術屬于新一代RNA原位雜交技術，其特異性的雙Z探針設計避免了傳統(tǒng)長鏈RNA探針的弊端，配以自身級聯(lián)放大檢測原理，可以高效敏感地檢測到目標RNA。該方法的具體優(yōu)勢如下：
應用廣泛
使用RNAscope技術，靶點RNA為大于等于300個堿基的特異序列，即可進行探針設計。因而RNAscope技術可以應用于幾乎所有物種，所有組織以及所有基因的檢測。
特異性強
RNAscope獨特的雙Z（ZZ） 探針設計有效的防止了探針的非特異性結合，同時降低了背景干擾。由于結合在非特異性位點的單個的Z 探針不會產(chǎn)生完整的信號放大分子結合位點，并會在雜交過程中被洗脫掉，從而防止非特異性信號的放大，使得探針的信號具有高度特異性。探針設計合成需要2~4周時間即可完成。
靈敏度高
RNAscope方法檢測每個RNA 分子時，只需三對雙Z（ZZ）探針即可完成雜交和信號的可視化。
單分子可視化和單細胞定量
使用RNAscope技術雜交上三對及以上雙Z 探針即可在標準的顯微鏡下呈現(xiàn)可觀察到的點狀信號。ACD公司提供的分析軟件更可以定量每一個單細胞內RNA 的表達水平。
兼容降解的RNA
由于RNAscope三對雙Z探針即可檢測到目標RNA，而通常針對靶點RNA設計的探針為20對雙Z 探針，因而即使目標RNA發(fā)生部分降解，仍可以穩(wěn)定有效地檢測到靶點RNA。
檢測結果穩(wěn)定一致性
RNAscope技術用到的探針以及所有檢測試劑全部由工業(yè)化合成，且該技術針對不同樣本類型（冰凍切片， 石蠟切片，懸浮細胞，貼壁細胞等）已經(jīng)有成熟的實驗操作流程，故使得RNAscope技術檢測結果具有穩(wěn)定性和一致性。除了可以在實驗室進行手工操作外，該產(chǎn)品也可以在Leica以及羅氏Ventana自動平臺上運行，為結果的一致性和穩(wěn)定性提供了可靠的依據(jù)。
多通道多靶點同時檢測
由于RNAscope技術可以同時進行多通道探針雜交以及信號放大，故在可見光檢測中可以在同一張切片上同時檢測兩個靶點；而在熒光檢測過程中，可以在同一張切片上檢測三個或三個以上靶點RNA。
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