RNAscope HiPlex結(jié)合鈣成像技術(shù)，解碼迷走神經(jīng)通路
負(fù)責(zé)我們認(rèn)知、意識的神經(jīng)活動主要發(fā)生于我們大腦內(nèi)部，負(fù)責(zé)體表的一系列感覺有外周神經(jīng)通路，而對于我們體腔內(nèi)的內(nèi)臟器官的感覺傳入和神經(jīng)支配，則主要由迷走神經(jīng)完成。迷走神經(jīng)負(fù)責(zé)的組織器官多樣，功能也各不相同，但迷走神經(jīng)核團是如何對各個內(nèi)臟的傳入信息進行區(qū)分和編碼，目前了解的不甚清晰。不同器官傳入的神經(jīng)元涉及種類繁多，對不同刺激產(chǎn)生應(yīng)答，了解不同類型神經(jīng)元的空間分布及分類特點，對于理解信息如何編碼匯聚非常重要。2022年3月，美國耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的常瑞實驗室與張樂實驗室合作在Nature上發(fā)表了一篇研究，通過使用RNAscope HiPlex結(jié)合單細(xì)胞測序、活體鈣成像等技術(shù)，對迷走神經(jīng)元進行了空間及細(xì)胞活動特征的研究[1]。
作者先在小鼠不同器官內(nèi)分別注射帶有熒光標(biāo)記和不同barcode的逆行AAV病毒，以此標(biāo)記不同器官來源的迷走神經(jīng)。然后分離出標(biāo)記好的迷走神經(jīng)元做單細(xì)胞測序，篩選總結(jié)出大量靶標(biāo)，及不同靶標(biāo)在每類神經(jīng)元中的相對表達量。隨后作者使用RNAscope HiPlex技術(shù)對篩選出的不同器官來源的迷走神經(jīng)元中感興趣靶標(biāo)進行了原位驗證，并將此方法稱之為“Projection-seq” （圖1）。在多個組織器官來源的迷走神經(jīng)元中原位驗證結(jié)果與單細(xì)胞測序結(jié)果匹配良好，且各靶標(biāo)相對表達量與單細(xì)胞測序接近。
圖1. Projection-seq驗證肺臟投射來源不同亞群迷走神經(jīng)元的靶標(biāo)分布。
隨后，作者在迷走神經(jīng)元中泛表達鈣指示劑GCamP6s，并在Gpr65陽性神經(jīng)元中表達紅色熒光蛋白指示劑，用于對神經(jīng)元進行定位。通過對小鼠肺、食管、胃腸道等不同內(nèi)臟器官或不同節(jié)段分別進行機械刺激，同時記錄迷走神經(jīng)元的鈣反應(yīng)情況，之后，再結(jié)合RNAscope HiPlex技術(shù)，對迷走神經(jīng)元進行多靶標(biāo)染色，通過紅色熒光蛋白定位，將RNA原位信息與鈣活動信息整合到一起。作者將此方法命名為“vCatFISH”。通過vCatFISH，得以讓我們看到對于相同器官的同一刺激，會有表達不同基因的神經(jīng)元產(chǎn)生反應(yīng)，說明對于同樣的刺激，在迷走神經(jīng)元中也存在多個維度的編碼。神經(jīng)系統(tǒng)通過對不同維度信息進行整合，最終幫助我們實現(xiàn)對刺激強度、時間、位置等具體細(xì)節(jié)的區(qū)分，從而使機體對不同情況進行應(yīng)對。而本篇文章的工作幫助我們未來對神經(jīng)活動進行解碼提供了一種新的選擇和啟發(fā)。
圖2. vCatFISH技術(shù)揭示了對于機體不同刺激反應(yīng)的神經(jīng)元的基因特征。
RNAscope技術(shù)是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研發(fā)的RNA原位雜交產(chǎn)品，在近年來的生物檢測領(lǐng)域發(fā)展迅速。與傳統(tǒng)的RNA原位雜交相比，RNAscope技術(shù)屬于新一代RNA原位雜交技術(shù)，其特異性的雙Z探針設(shè)計避免了傳統(tǒng)長鏈RNA探針的弊端，配以自身級聯(lián)放大檢測原理，可以高效敏感地檢測到目標(biāo)RNA。該方法的具體優(yōu)勢如下：
應(yīng)用廣泛
使用RNAscope技術(shù)，靶點RNA為大于等于300個堿基的特異序列，即可進行探針設(shè)計。因而RNAscope技術(shù)可以應(yīng)用于幾乎所有物種，所有組織以及所有基因的檢測。
特異性強
RNAscope獨特的雙Z（ZZ） 探針設(shè)計有效的防止了探針的非特異性結(jié)合，同時降低了背景干擾。由于結(jié)合在非特異性位點的單個的Z 探針不會產(chǎn)生完整的信號放大分子結(jié)合位點，并會在雜交過程中被洗脫掉，從而防止非特異性信號的放大，使得探針的信號具有高度特異性。探針設(shè)計合成需要2~4周時間即可完成。
靈敏度高
RNAscope方法檢測每個RNA 分子時，只需三對雙Z（ZZ）探針即可完成雜交和信號的可視化。
單分子可視化和單細(xì)胞定量
使用RNAscope技術(shù)雜交上三對及以上雙Z 探針即可在標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡下呈現(xiàn)可觀察到的點狀信號。ACD公司提供的分析軟件更可以定量每一個單細(xì)胞內(nèi)RNA 的表達水平。
兼容降解的RNA
由于RNAscope三對雙Z探針即可檢測到目標(biāo)RNA，而通常針對靶點RNA設(shè)計的探針為20對雙Z 探針，因而即使目標(biāo)RNA發(fā)生部分降解，仍可以穩(wěn)定有效地檢測到靶點RNA。
檢測結(jié)果穩(wěn)定一致性
RNAscope技術(shù)用到的探針以及所有檢測試劑全部由工業(yè)化合成，且該技術(shù)針對不同樣本類型（冰凍切片， 石蠟切片，懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞等）已經(jīng)有成熟的實驗操作流程，故使得RNAscope技術(shù)檢測結(jié)果具有穩(wěn)定性和一致性。除了可以在實驗室進行手工操作外，該產(chǎn)品也可以在Leica以及羅氏Ventana自動平臺上運行，為結(jié)果的一致性和穩(wěn)定性提供了可靠的依據(jù)。
多通道多靶點同時檢測
由于RNAscope技術(shù)可以同時進行多通道探針雜交以及信號放大，故在可見光檢測中可以在同一張切片上同時檢測兩個靶點；而在熒光檢測過程中，可以在同一張切片上檢測三個或三個以上靶點RNA。
在RNAscope技術(shù)的基礎(chǔ)上，ACD公司旗下的Basescope技術(shù)可以檢測RNA水平的外顯子跳躍，點突變，環(huán)狀RNA等；miRNAscope可以原位對小RNA，包括miRNA, siRNA, ASO進行追蹤定位；而近年來推出的RNAscope HiPlex技術(shù)則可以在一張石蠟切片上同時檢測最多12個RNA靶標(biāo)的分布定位，成為神經(jīng)科學(xué)，腫瘤微環(huán)境研究以及單細(xì)胞測序后驗證等領(lǐng)域的常用檢測方法。
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